В 1956 г. они впервые обнаружили у больных, леченных инсулином, непреципитирующие антитела, способные связывать 131I-инсулин. Затем эта научная группа показала, что немеченый инсулин конкурирует с меченым за связывание с антителами и вытесняет его из иммунных комплексов. Впоследствии Berson и Yalow разработали первый метод РИА для измерения концентрации инсулина в сыворотке, за что они были удостоены Нобелевской премии. В этом методе инсулин, связанный с антителами, отделяли от несвязанного инсулина путем электрофореза на бумаге. Примерно в то же время, в 1960-х гг., Grodsky и Forsham описали сходный метод РИА с использованием 131I-инсулина, но для разделения связанного и несвязанного гормонов они вместо электрофореза применяли высаливание.

Огромный вклад в развитие РИА внесли Hales и Randle в 1963 г. Для разделения связанного и несвязанного гормонов они применили антитела против у-глобулинов, так называемые вторичные антитела. Этот подход основывался на результатах работ Skom и Talmadge, которые в 1958 г. показали, что вторичные антитела вызывают преципитацию комплексов «антиген—первичное антитело». Метод Hales и Randle, получивший название «метода двойных антител», оказался значительно более чувствительным и специфичным, чем прежние варианты РИА.

В 1963 г. Herbert et al. разработали методику отделения комплексов «антиген—антитело» от несвязанного антигена при помощи активированного угля, покрытого декстраном. В основе методики лежит свойство угольно-декстрановой смеси практически мгновенно абсорбировать свободный антиген, не связывая при этом комплексы антиген-антитело. Эта методика позволяет отделять иммунные комплексы гораздо быст7 рее, чем преципитационные методики, поэтому в ней можно использовать 131I-антигены с низкой удельной активностью, меченные по Hunter и Greenwood.

В то же самое время Utiger et al. расширили область применения РИА, разработав способ количественного определения человеческого СТГ. Позднее Greenwood et al. внедрили методику йодирования СТГ, позволяющую получать меченый гормон с удельной активностью 200— 500 мКи/мг (6000-9000 Ки/ммоль).

Эта методика используется и поныне. Суть ее заключается в том, что изотоп йода (1311 или 1251) в составе йодида натрия окисляется хлорамином Т и в таком виде замещает один или несколько атомов водорода в фенольном кольце тирозина и в имидазольном кольце гистидина. Через 1 мин к реакционной смеси добавляют восстановитель, чтобы избежать излишнего повреждения гормона. Отметим, что принцип окислительного йодирования белков был описан Hughes еще в 1957 г. В дальнейшем Meyer и Knobil разработали РИА для измерения человеческого и обезьяньего СТГ, в котором для отделения несвязанного гормона применялся активированный уголь.

Первый РИА для измерения уровня гонадотропных гормонов (в данном случае — ЛГ), разработанный в 1966 г., основывался на использовании антител к человеческому ХГ, поскольку ранее было показано, что эти антитела связываются и с человеческим ЛГ. Один из экспериментов в этой области произвел настоящую революцию в иммунохимии: Catt et al. обнаружили, что антитела способны прилипать к дискам из диазотированного полистирола. Таким образом, отпала необходимость в отделении комплексов антиген—антитело с помощью преципитации или абсорбции. Позднее Catt et al. научились иммобилизировать антитела непосредственно на ненасыщенном полистироле в щелочной среде. Результаты этих работ послужили основой для создания ИФА (см. ниже). Faiman и Ryan впервые сумели получить антисыворотку к гипофизарному гонадотропину — человеческому ЛГ. В дальнейшем были разработаны РИА для определения крысиного ЛГ.

Разработка РИА для измерения уровня ФСГ, как и в случае с ЛГ, начиналась с прицелом на будущие клинические исследования. В 1967 и 1968 гг. несколько научных групп сообщили о новых методах РИА для разных форм человеческого ФСГ. Все они были основаны на методе двойных антител.

В 1967 г. Aria и Lee впервые объявили о способе определения пролактина, основанного на методе двойных антител. Первые измерения уровня пролактина методом РИА были проведены, за отсутствием человеческого материала, в овечьей и бычьей плазме.

Теоретические основы РИА

Первые методы РИА (например, методы Berson и Yalow или Grodsky и Forsham) были основаны на феномене конкурентного ингибирования. Этот феномен заключается в том, что связывание меченого изотопом гормона (меченого антигена) со специфическими антителами подавляется в присутствии немеченого гормона (немеченого антигена). Феномен конкурентного ингибирования можно описать двумя уравнениями: «меченый антиген + антитело меченый комплекс» и «немеченый антиген + антитело <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Обычно РИА проводят при температуре 4 или 37°С в фосфатно-солевом буферном растворе при рН 7 или 8. Реакция может длиться от 2 до 24 ч (в зависимости от аффинности антител и желаемого уровня чувствительности). Отметим, что автоматизация анализа и усовершенствование способов получения антител значительно сократили время реакции. Когда в реакционной смеси устанавливается равновесие, комплексы антиген—антитело отделяют преципитацией с помощью вторичных антител, абсорбцией свободных антигенов и антител на активированном угле, или осаждением в среде с высокой плотностью, например в среде с полиэтиленгликолем. Если же это твердофазный РИА, то инкубационную среду просто удаляют, а комплексы антиген—антитело остаются на полистироле или другой твердой фазе. На последнем этапе измеряют радиоактивность комплексов. Если гормон был помечен 125I или 131I, используют счетчик у-излучения, если меткой служил 3Н, используют сцинтилляционный счетчик β-частиц. Концентрации гормона в пробах рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по результатам измерений в стандартных образцах с известными концентрациями гормона.

Алгоритм установления диагноза ГБ плода/новорожденного, обусловленной АВ0 антителами

│ Сопоставить результаты │ │ Оценить клинику ГБ │

│ исследования группы крови │ │ Определить группу крови │

│ ребенка и АВ0 антител матери │ │ новорожденного │

│ Мать-плод │ │ Мать-плод АВ0 ││ │ Клиника ГБ │ │Клиники ГБ нет │

│ АВ0 │ │ несовместимы │└───┤ ПАГТ+- │ │ ПАГТ- │

│ Мать имеет │ │ Мать не имеет антител │

│ антитела │ │ другой специфичности, │

│ другой │ │ кроме АВ0 (IgG) │

Е.8. Лабораторное подтверждение диагноза ГБН, обусловленной антителами к антигенам системы Резус и другим системам антигенов эритроцитов. Используются критерии:

1. Имеются клинические доказательства наличия заболевания у плода/новорожденного.

2. Исследования показывают, что сыворотка матери содержит аллоантитела, специфичность которых установлена.

3. Доказано, что новорожденный имеет антиген эритроцитов, против которого у матери есть антитела (по результатам фенотипирования эритроцитов).

Получение антител

Поликлональные антитела для РИА получают путем иммунизации антигеном (гормоном) животных разных видов, в том числе кроликов, кур, морских свинок, уток, коз и овец. Для получения первичных антител (против гормона) обычно используют кроликов и морских свинок, для получения вторичных антител (против первичных) — овец и коз.

Существует множество методов иммунизации, самый распространенный — инъекция антигена в подушечку лапы, или в регионарный лимфоузел, или в селезенку. Так как в организме хозяина антигены существуют очень недолго, для надежной индукции иммунного ответа используют адъювант Фрейнда. Неиммуногенные антигены с небольшой молекулярной массой (например, стероидные гормоны) и антигены с низкой иммуногенностью перед иммунизацией присоединяют к крупным молекулам или частицам (метилированному альбумину, ферритину, декстрану, сефадексу и т. п.). Обычно иммунизацию проводят в несколько этапов с интервалами в 2 недели. Как правило, после нескольких инъекций титр антител в сыворотке быстро растет. Кровь для получения иммунной сыворотки берут из полостей сердца или из вен и артерий уха. Последний способ чаще всего применяют у кроликов. Полученную сыворотку инкубируют 30 мин при 57°С для разрушения комплемента. Затем к сыворотке добавляют консервант, предотвращающий рост бактерий и грибов (азид натрия или тиомерсал).

Показания для проведения исследования

Иммунный статус человека изучают с применением различных методик и тестов. Выделяют два основных вида исследований: иммуноферментный анализ (ИФА) и радиоиммунный анализ (РИА). Для изучения иммунного статуса применяют определенные тест-системы. При радиоиммунном анализе результаты измеряют на счетчиках радиоактивности. Для проведения ИФА существует большое количество различных тест-систем. Основными видами иммуноферментных анализов являются: ингибиторный, «сэндвич», иммунометрический, твердофазный непрямой ИФА, метод иммуноблота.

Выделяют ряд патологических нарушений, при которых иммунологическое исследование крови проводят в обязательном порядке. Первоочередным анализом при пересадке органов является именно иммунограмма, в особенности, если пациент ребенок. Значение показателей важны при подборе лечения онкологических заболеваний. Соответствие норме определяют после терапии иммунодепрессантами, так как препараты снижают защитную функцию организма. Иммунограмму назначают при таких патологических нарушениях как:

• наследственные нарушения в функционировании иммунной системы;
• обильные кровопотери;
• вирусные и паразитарные инфекции различной этиологии (сифилис, лямблиоз, гепатиты герпес и другие);
• онкологические заболевания;
• патологии эндокринной системы;
• физиологические нарушения иммунной системы (при беременности, в старческом и детском возрастах);
• аутоиммунные заболевания;
• ВИЧ инфекции;
• пневмонии с частыми рецидивами;
• продолжительные грибковые инфекции;
• хронические воспалительные процессы;
• гнойные поражения кожных покровов;
• сильные эмоциональные потрясения, затяжные депрессии;
• длительное пребывание в местах с загрязненной экологией.

Исследование иммунного статуса особенно важно при обследовании пациентов с ВИЧ-инфекцией. Результаты анализов позволяют оценить степень поражения защитной системы организма. Исследование иммунограммы облегчает подбор препаратов для лечения и выбор направления терапии. Снижение защитной функции может привести к развитию тяжелых заболеваний. При длительном нарушении самочувствия рекомендуется сдать анализ крови на иммунитет и проверить состояние здоровья.

Моноклональные антитела

В 1975 г. Kohler и Milstein разработали принципиально новую — гибридомную — технологию получения антител. Позже эта разработка была отмечена Нобелевской премией. Опишем основные элементы этой технологии.

Мышей или крыс иммунизируют антигеном, например гормоном. Когда титр антител в сыворотке становится достаточно высоким, у иммунных животных из селе зенки выделяют плазматические клетки среди которых есть и клетки — продуценты антител к исходному антигену. Плазматические клетки гибридизуют in vitro клетками миеломы, происходящими о животных того же вида. Затем клеточную суспензию переносят в селективную среду, в которой выживают только гибридные клетки, а плазматические и миелом ные клетки погибают. Гибридные клети по одной рассевают в лунки с питатель ной средой, где они делятся и образую гибридомы (бессмертные клеточные линии). Среди множества гибридом отбирают те, которые продуцируют антитела нужному антигену, и размножают их питательной среде либо в брюшной полости сингенных мышей. Из питательно; среды или асцитической жидкости выделяют антитела. Эти антитела называют моноклональными, поскольку они продуцируются гибридомой, являющейся потомком одной-единственной плазматической клетки. Моноклональные антитела, вырабатываемые одной гибридомой, распознают только одну детерминанту какого-либо антигена. В этом и состоит принципиальное отличие моноклональных антител от поликлональной антисыворотки, в которой обычно содержится несколько разных антител к различным детерминантам одного антигена.

Одно из важных преимуществ моноклональных антител перед поликлональными заключается в том, что один и тот же вид моноклональных антител с определенной специфичностью и аффинностью можно получать в любых количествах и практически бесконечно (поскольку гибридома бессмертна). Напротив, антительный состав поликлональных антисывороток весьма изменчив, что требует проверки каждой новой партии антисыворотки и подбора условий ее применения. Таким образом, использование моноклональных антител существенно облегчает стандартизацию РИА и других иммунохимических методов анализа.

Что такое контроль качества

Применительно к медицинской диагностике термин «качество» означает достоверность полученных результатов, что подразумевает максимально возможное исключение влияния вариативных факторов внутрииндивидуальной изменчивости и ошибок медперсонала.

Контролем качества лабораторных исследований называют совокупность мероприятий, направленных на подтверждение соответствия фактических данных диагностической информации объективным значениям, необходимым для правильной оценки состояния пациента. В более узком смысле это означает проверку каждого этапа на соответствие требованием стандарта. Контроль качества долабораторной стадии подразумевает установление соответствия каждой ступени процесса ГОСТу преаналитического этапа и другим документам, разработанным на частном уровне.

Наличие стандартов играет огромную роль в минимизации диагностических ошибок, но все же не может исключить субъективный фактор. В настоящее время контроль соблюдения правил преаналитического этапа лабораторных исследований представляет собой проблему, поскольку периодические внешние и внутренние проверки сложно назвать эффективными.

Тем не менее приближение технологии процесса к единой системе и внедрение более удобных для персонала способов работы с биоматериалом могут стать выходом из этой ситуации. Одним из таких нововведений стало использование вакуумных пробирок для сбора крови, которые пришли на замену шприцу.

В списке медицинских государственных стандартов можно выделить 2 основных документа, направленных на обеспечение качества преаналитического этапа:

• ГОСТ 53079 2 2008 (часть 2) — содержит руководство по управлению качеством всего процесса лабораторной диагностики.
• ГОСТ 53079 4 2008 (часть 4) — регламентирует непосредственно преаналитическую стадию.

Одним из ключевых аспектов контроля качества является координация между группами персонала, задействованного в разных стадиях лабораторной диагностики.

Получение гормонов, меченных радиоактивными изотопами

Как уже говорилось, для йодирования белковых гормонов чаще всего применяют метод, предложенный Greenwood и Hunter. Изначально в качестве метки использовали 131I, но из-за короткого периода полураспада этого изотопа (8 сут) срок годности меченого гормона был невелик. В 1967 г. Wilde et al. применили для йодирования 125I (Т1/2 = 60 сут). С тех пор этот изотоп применяется для мечения любых белковых и некоторых небелковых гормонов. При этом получаются меченые гормоны с удельной активностью 100—250 мКи/мг. Этого вполне достаточно для надежной регистрации излучения на счетчике ϒ-частиц.

Для мечения небелковых гормонов используют и другие радиоактивные изотопы, такие как излучатели β-частиц 3H или 14C. Меченные 3H или 14C стероиды применяют не только в иммунохимическом анализе гормонов, но и в фундаментальных эндокринологических исследованиях, например для изучения локализации рецепторов стероидов в разных клетках и тканях экспериментальных животных.

Стандартизация

Чтобы минимизировать внутрииндивидуальную вариацию лабораторных результатов, организация преаналитического этапа должна быть упорядочена и подчинена определенным нормативам.

В стандартизацию долабораторного этапа входят:

• правила назначения анализов (предназначены для лечащего врача);
• основные аспекты подготовки пациента к исследованию;
• инструкции по взятию биоматериала;
• правила подготовки проб, хранения и транспортировки клинического материала в лабораторию;
• идентификация проб.

Ввиду широкой специфики различных лечебных учреждений и КДЛ, единого стандарта, подробно регламентирующего их деятельность, не существует. По этой причине разработаны общие документы (международные и отечественные), содержащие универсальные требования к организации преаналитического этапа лабораторных исследований. Эти правила учитываются при составлении индивидуальных стандартов на уровне конкретных медицинских организаций.

Требования к взятию биоматериала

Порция любого биоматериала, взятая для осуществления анализа, называется пробой или образцом, забор которого осуществляется согласно инструкциям с целью определения характеристик инспектируемого лота (пациента).

Для каждого типа анализа в ГОСТе указаны свои рекомендации, однако они носят обобщенный характер и не включают подробное описание технологии забора материала, которой четко должен следовать медицинский работник. Однако в документе перечислены требования к квалификации персонала, которые подразумевают хорошее знание методологии.

Правила первичной обработки биоматериала

Красная/белая	Не содержит добавок, используется для клинико-химических и серологических исследований, а также сыворотки
Зеленая	Содержит гепарин, предназначена для плазмы и клинико-химического анализа
Фиолетовая	Содержит ЭДТА, предназначена для плазмы и гематологических исследований
Серая	Используется в анализах для определения глюкозы и лактата, содержит фторид натрия

Идентификационная маркировка образцов биоматериала осуществляется при помощи штрихкодов, в которых зашифрованы Ф. И. О. пациента, название врачебного отделения, имя врача и другая информация. В небольших учреждениях допустимо использовать ручную кодировку, представленную в виде цифр или условных знаков, нанесенных на содержащие пробы емкости.

Кроме идентификационной маркировки, к первичной обработке биоматериала относят мероприятия, направленные на сохранение стабильности образца до момента обследования (центрифугирование крови, инактивация нуклеаз, использование раствора мертиолят-фтор-формалина для концентрации и сохранения паразитов и др.).

ГОСТ 5353079 4 2008 — обеспечение качества преаналитического этапа

Этот стандарт был разработан на базе двух Московских медицинских академий и законодательно утвержден в декабре 2008 года. Документ предназначен для использования всеми типами предприятий (как частных, так и государственных), связанных с оказанием медпомощи.

В данном ГОСТе содержатся основные правила преаналитического этапа лабораторных исследований, предназначенные для исключения или ограничения факторов вариабельности диагностики, препятствующих правильному отражению физиолого-биохимического состояния организма пациента.

В регламент стандарта входят:

• описание условий, которые должны соблюдаться пациентом при подготовке к анализу (содержатся в приложении А);
• правила и условия взятия биоматериала;
• требования к первичной обработке образцов;
• правила хранения и транспортировки биологического материала в КДЛ (клинико-диагностические лаборатории).

Требования по обращению с биоматериалом обязательно включают технику безопасности по работе с потенциально патогенными образцами.

ГОСТ преаналитического этапа лабораторных исследований подразумевает подробный инструктаж персонала медучреждения и информирование пациентов о правилах подготовки и проведения анализов. Согласно документу, процесс взятия и маркирования материала должен быть четко организован, а лаборатории снабжены всем необходимым оборудованием для забора, хранения и транспортировки проб.

Содержание ГОСТа преаналитического этапа лабораторных исследований основывается на обобщенных научных данных о влиянии физических, химических и биологических факторов на состояние клеточного и вещественного содержимого взятых у пациента материалов.

Сведения о стабильности компонентов биоматериала находятся в приложениях Б, В и Г, а данные о влиянии принятых накануне анализа лекарственных препаратов на результаты исследований — в приложении Д.

Правила преаналитического этапа клинических лабораторных исследований, указанные в ГОСТе, носят характер универсальных обобщающих рекомендаций и не являются полноценной методической рекомендацией для осуществления связанных с анализами процедур. Полноценная инструкция представляет собой совокупность медицинских знаний и навыков, согласованных со стандартом и особенностями организации диагностического процесса медицинского учреждения.